附錄Ⅻ A 無菌檢查法
無（wú）菌檢查法係用於檢查藥典要求無菌（jun1）的生物製品、醫療器具、原料（liào）、輔料、及其他品種是（shì）否無菌的一種方法。若（ruò）供試品符合無菌（jun1）檢查法的規定,僅表明了供（gòng）試品（pǐn）在（zài）該檢驗條件下未發現（xiàn）微（wēi）生（shēng）物汙染。
無菌檢查應在環境潔淨度 10 000 級下的局部潔（jié）淨度 100 級的單向流空（kōng）氣區域內或隔離係統中進行，其全過程應嚴格遵守（shǒu）無菌操作，防止微（wēi）生物（wù）汙染（rǎn），防止汙染的措（cuò）施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區（qū）、工作台麵及環（huán）境應定期按《醫藥工業潔淨室（區）懸浮粒子（zǐ）、浮遊菌和沉降菌的測試方法》的現行國（guó）家標準進行（háng）潔淨度驗證。隔離係統應按相關（guān）的（de）要求進行驗證，其內部環境的潔淨（jìng）度須符（fú）合無菌檢查的要求。日常檢驗還需對（duì）試驗環境進行監（jiān）控（kòng）。
無菌檢查人員必須具備微生物專業知識，並經過無菌技術的培（péi）訓。
培養基（jī）
培養（yǎng）基的製（zhì）備
培養基可按以下處方製備（bèi），亦可使用按該（gāi）處方生產的符（fú）合規定的脫水培養基。配製後應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。製備好的培養基應保（bǎo）存在 2℃～ 25℃、避光的環境，若保存於非密閉容器中，一（yī）般在三周內使用；若保存於密閉容器中，一般可（kě）在一年內使用。
1. 硫乙醇酸鹽流體培養基
酪腖 (胰酶水解（jiě）) 15.0g 酵母浸出粉 5.0g
葡萄糖 5.0g 氯化鈉 2.5g
L-胱氨酸（suān） 0.5g 新配製的 0.1% 刃天青溶液 1.0 ml
硫乙醇（chún）酸（suān）鈉（nà） 0.5g 瓊脂 0.75g
(或硫（liú）乙醇酸) （ 0.3 ml) 水 1000 ml
除葡萄糖和刃天青溶液外，取（qǔ）上述成分混合，微溫溶解，調節 pH 為弱堿性，煮沸，濾清，加入葡萄糖和刃天青溶液，搖勻，調節 pH 值使（shǐ）滅菌後為 7.1 ± 0.2 。分裝至適宜的容器（qì）中，其裝量與容器高度的比例應符合培養結束後培（péi）養基氧化層（粉紅色）不超過培養基深度的 1/2 ，滅菌。在供試（shì）品接種前（qián），培養基氧化層的高（gāo）度不得超過（guò）培養基深（shēn）度的 1/5 ，否則，須經 100 ℃水浴加熱（rè）至粉紅色消失（不超過 20 分鍾），迅速冷卻，隻限加熱一次，並防止被汙染。
2.改良馬丁培養基
腖（dòng） 5.0g 磷酸氫二鉀 1.0g
酵母浸出粉 2.0g 硫酸（suān）鎂 0.5g
葡萄糖 20.0g 水 1000 ml
除葡萄糖外，取（qǔ）上述（shù）成分混合，微溫溶解，調節 pH 值約（yuē）為 6.8 ，煮沸，加入葡萄糖溶（róng）解後，搖勻（yún），濾清，調節 pH 值使滅（miè）菌後為 6.4 ± 0.2 ，分裝，滅菌。
3.選擇性培養基
按上述硫乙醇酸鹽流體培養基或（huò）改良馬丁培養基的處方及製法，在培養基滅菌或使用前加入適宜的中和劑（jì）、滅活劑或表麵活性劑，其用量同驗證試驗。
4.營養肉湯培養基
腖（dòng） 10.0g 氯化鈉 5.0g
牛肉浸出粉 3.0g 水 1000 ml
取上述成分混合，微溫溶解，調節 pH 為弱堿性，煮沸，濾清，調節 pH 值使滅菌後為 7.2 ± 0.2 ，分裝，滅菌（jun1）。
5. 營養瓊脂培養基
按上述（shù）營養（yǎng）肉湯培養基的處方及製（zhì）法，加入 14.0g瓊脂，調（diào）節 pH 值使滅菌後為 7.2 ± 0.2 ，分裝，滅菌。
6. 改良馬丁（dīng）瓊脂培養基
按改良馬丁培養基的處方及製（zhì）法，加入 14.0g瓊脂，調節 pH值使滅菌後為 6.4 ± 0.2，分裝，滅菌。
培養基的（de）適用性檢查
無菌檢查用的硫乙醇酸鹽（yán）流體培養基（jī）及改良馬丁培養基應符合培養基（jī）的無菌性檢查及靈（líng）敏度檢查的要求。本檢查可在供試品的無菌檢查前或與供試品的無菌檢查同（tóng）時進行。
無菌性檢查 每批培養基隨機抽取不少於 10 支（瓶），5支（瓶）置30℃～35℃另5支（瓶（píng））置20℃～25℃培（péi）養 14 天，均應無菌生長.
靈敏度檢查
菌種：培養基（jī）靈敏度檢查所用的菌株傳代次數不得超過 5 代（dài）（從菌種保存中（zhōng）心獲得的冷凍幹燥菌種為第 0 代），試驗（yàn）用菌種應采用適宜的菌種保（bǎo）存技術進行（háng）保存，以保證試驗菌株的生物學（xué）特性。
金黃色葡萄球（qiú）菌( Staphylococcus aureus)〔CMCC(B) 26 003〕
銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 〔CMCC(B) 10 104〕
枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis）〔CMCC（B）63 501〕
生孢梭菌( Clostridium sporogenes)〔CMCC(B) 64 941〕
白色念珠（zhū）菌( Candida albicans)〔CMCC(F) 98 001〕
黑曲黴( Aspergillus niger) 〔CMCC(F) 98 003〕
菌液製備 接種（zhǒng）金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽（yá）孢杆菌的新鮮培養物至營（yíng）養肉（ròu）湯培養基中或營（yíng）養瓊脂培（péi）養（yǎng）基上，接種生孢梭菌（jun1）的新鮮培養物至硫乙醇酸鹽流體培養基中，30℃～35℃培（péi）養18小時～24小時（shí）；接種白色（sè）念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁（dīng）培養基（jī）中或改良馬丁瓊脂培養基上，20℃～25℃培養24小時（shí）～48小時，上（shàng）述（shù）培養物用 0.9%氯化鈉溶液製成每1ml含菌數小於 100 cfu（菌落形成單（dān）位）的菌懸液（yè）。接（jiē）種黑曲（qǔ）黴的新鮮培（péi）養物至改良馬丁瓊脂培養基上，23℃～28℃培養 5天～7天，加入 3ml～5ml 無（wú）菌的（de）含 0.05％（v/v）聚山梨酯 80的0.9%氯化鈉溶液，將孢子（zǐ）洗脫。然後，用適宜的方法吸出（chū）孢子懸液至無菌試管內，用無菌的含 0.05％（v/v）聚山梨酯 80的（de）0.9%氯化鈉（nà）溶液製成每 1ml含孢子數小於100 cfu的孢子懸（xuán）液（yè）。
菌懸液在室溫下放置應在2小時內使用，若保存在2℃～8℃可在24小時內使用。 黑曲黴（méi）孢子懸液可保存在2℃～8℃，在驗證過的貯存期內（nèi）使用。
培（péi）養基接（jiē）種 取每管裝量為 12ml的硫乙醇酸鹽流（liú）體培養基 9支，分別接（jiē）種小於100 cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假（jiǎ）單胞菌、枯草（cǎo）芽孢杆菌、生孢梭菌（jun1）各（gè） 2支，另 1支不接種作為空白對照，置30℃～35℃培養3天（tiān）；取每管裝量為9ml的改良馬丁培養基5支,分別接（jiē）種小於（yú） 100 cfu的白色念珠菌、黑曲黴（méi）各 2支，另 1支不接種作（zuò）為空白對照（zhào），置20℃～25℃培養5天。逐日觀察結（jié）果。
結果判定 空白（bái）對照管應無菌生長，若加菌的培養基管均生長良好，判該培養基（jī）的靈敏度檢查符合規定。
稀釋液、衝洗液（yè）及其製備方法
稀釋液、衝洗液配（pèi）製後應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。
1. 0.1%蛋白腖水溶液 取蛋白腖 1.0g，加水 1000ml，微（wēi）溫溶（róng）解，濾清，調節 pH值至（zhì） 7.1±0.2，分裝，滅菌。
2. pH7.0氯（lǜ）化鈉-蛋白腖緩衝（chōng）液 取（qǔ）磷酸二氫鉀 3.56g ，磷酸（suān）氫二鈉 7.23g，氯化鈉4.30g，蛋白腖 1.0g，加水 1000ml ，微溫溶解，濾清，分裝，滅菌。
3. 0.9%氯化鈉溶液 取氯化鈉（nà）9.0g，加水溶解使成1000ml，過（guò）濾，分裝，滅菌(僅用於上述兩種溶液不適用（yòng）時使（shǐ）用)。
4. 根據供（gòng）試品的（de）特性，可選用其他（tā）經驗證過的適宜的溶液作（zuò）為稀釋液、衝洗液。
如需要，可（kě）在上述稀釋液或衝洗液（yè）的滅（miè）菌前或（huò）滅菌後加入表麵（miàn）活性（xìng）劑或中和劑等（děng）。
方法驗證（zhèng）試驗
當建（jiàn）立產品的無菌檢查法時，應進行（háng）方法的（de）驗證（zhèng），以（yǐ）證明所采用的方法（fǎ）適合（hé）於該產品的無菌檢查。若該產品的組分或原檢驗條件發生改變時，檢查方法應重新驗證。
驗證時，按"供試品的無菌檢查"的規定及（jí）下列要求進行操作。對每一試驗菌應逐一進行驗證。
菌種及菌液製備 同培養基靈敏度檢查。
薄膜過濾法 取每種培養基規定接種的（de）供試品總量按薄膜過濾法過濾，衝洗，在最後一次的衝洗液中加入（rù）小於100 cfu的試驗（yàn）菌，過濾。將培養基加至濾筒內。另取一裝有同體積培（péi）養基的容器，加入等量試驗菌，作（zuò）為對照，細（xì）菌（jun1）置（zhì）30℃～35℃、真菌置20℃～25℃培養（yǎng）3天～5天（tiān），逐日觀（guān）察各濾筒內試驗菌的生長情況。
直接接種法 取符（fú）合直接接種法（fǎ）培養基用量要求的硫乙醇酸鹽流體（tǐ）培養基8 管，分別接入小於 100 cfu的金黃色葡萄（táo）球菌、銅（tóng）綠假單胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌（jun1）各 2管，取符合直接接種法培養基用量要求的改良馬丁培養基 4管，分別接（jiē）入小於100 cfu的白色念珠菌、黑曲黴各（gè） 2管（guǎn）。其中1管接入每支培養基規定量的供試品量，另 1管（guǎn）作為對照（zhào），細菌置30℃～35℃、真（zhēn）菌置（zhì）20℃～25℃培養3天～5天，逐日觀察各濾筒內試驗（yàn）菌的生長情（qíng）況。
結果（guǒ）判斷 與（yǔ）對照管比較，如（rú）含供試（shì）品（pǐn）各容器中的試驗菌均生長良好，則說明供試品的該檢驗（yàn）量在該檢（jiǎn）驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，照此檢查方法和檢查條件（jiàn）進（jìn）行供試（shì）品的（de）無菌檢查。如含供試品的任（rèn）一容器中的試驗菌生長微弱、緩慢或不生長（zhǎng），則說明供試品的該檢驗（yàn）量在該檢驗條件下有抑菌作用，可采用增加衝（chōng）洗（xǐ）量、增（zēng）加培養基的用量、使用中和劑或滅活劑、更換濾膜品種等方法（fǎ），消除供試品的抑菌（jun1）作（zuò）用，並重新進行方法驗證試驗。
驗證試驗也可與供試品的無菌檢查同時進行。
供試品（pǐn）的無菌檢查
抽驗數量 是指（zhǐ）一次試驗所用供試品（pǐn）最小（xiǎo）包裝容器（qì）的數量（支或瓶）。成品每亞（yà）批均應進行無菌檢（jiǎn）查。除另有規定（dìng）外，原液、半成品及成品按表1規定，上市產品（pǐn）監督檢驗按表2規定。
接種量 是（shì）指每個最小包裝的最少取樣量（ml或g）。除另有規定外，接（jiē）種供（gòng）試品量按表3規定。若采用直接接種法，按接種量要求等量（liàng）分別（bié）接種至硫乙醇酸（suān）鹽流體培養基和改良（liáng）馬丁培養基中（兩種培養基的接種支/瓶數（shù）之比為2：1）；若采用薄膜過濾法，應采用三聯薄膜過濾器，其中兩聯加入（rù）硫乙（yǐ）醇酸鹽流體培養基，另一聯加（jiā）入改良馬丁（dīng）培養基。隻要供試品特性允許，應將所有容器內的內容物全部過濾。
陽性（xìng）對照 以（yǐ）金黃色葡萄球菌作為（wéi）陽性對照菌。供（gòng）試品用量同供試品無菌檢查每份培（péi）養基接種的樣品量。陽性對照試驗的菌液（yè）製備同培養基靈敏度檢查項（xiàng）下金黃色葡萄球（qiú）菌菌液製備方法，加菌量小於 100cfu。陽性對照也可在供試品無菌檢查培養14天後，取（qǔ）其中一（yī）份硫乙醇酸（suān）鹽（yán）流體培養基，加入小於 100cfu陽性對照菌（jun1），作為陽性對照。陽（yáng）性對照置30℃～35℃培（péi）養 48小時～72小時應生長良（liáng）好。
陰性（xìng）對照 供試品無（wú）菌（jun1）檢查時，應取相應溶劑、稀釋液和衝洗液同法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。
無菌試驗過程中，若需使用表（biǎo）麵活性劑、滅（miè）活劑、中和劑等試劑，應證明其有效性，且對微生物生長無毒性。
無菌檢查法包（bāo）括薄膜過濾法和直接接種（zhǒng）法（fǎ）。隻要供試品性狀允許，應采用薄膜過濾法。供試品的無（wú）菌檢查所采用的檢查方法和檢驗條件（jiàn）應與驗證的方法相同。
操（cāo）作時，用適（shì）宜的消毒液對供試品容（róng）器表麵進行徹底消毒，如果供試（shì）品容器內有一定的（de）真空度，可用適宜的無（wú）菌器材（如帶有除菌過濾器的針頭）向（xiàng）容（róng）器內導入無菌空氣（qì），再按無菌操（cāo）作起開容器取出內容物。
供試品處理及（jí）接種培養基
除另有規定外，按（àn）下列方法進行（háng）。
1.薄膜（mó）過濾法
采用封閉式薄膜過濾器，濾膜孔徑應（yīng）不大於 0.45μm，直徑約為 50mm。根據供試品及其溶劑（jì）的特性選擇濾膜材質。使用時，應（yīng）保證濾膜在過濾前後的完整性。
水溶性供試液過濾（lǜ）前先將少（shǎo）量的（de）衝洗（xǐ）液（yè）過濾（lǜ）以潤濕濾膜。油類供試品，其濾（lǜ）膜和過濾器在使用前應充分幹（gàn）燥。為發揮濾膜的最大過濾效率，應注意保持供試品溶液（yè）及衝洗液覆蓋整（zhěng）個濾（lǜ）膜表麵。供試液經薄（báo）膜過濾後，若需要用衝洗液衝洗濾（lǜ）膜，每（měi）張濾膜每次衝洗量一般（bān）為100ml，總衝（chōng）洗量（liàng）不得（dé）超過1000ml，以避免濾膜上的微生物受損傷。
水溶液供試品（pǐn） 取規定量，裝量小於10ml者，全部轉移至含適宜稀釋液300ml的無菌容器內，混勻，立即過濾；裝量（liàng）為10ml及以上（shàng）者直接過濾，或全部轉移至含適量稀釋液（yè）的（de）無菌容器內，混勻，立即過濾。如供試品具有抑菌作用或（huò）含防腐劑（jì），須用衝洗液衝洗濾（lǜ）膜，衝洗次數一般不少（shǎo）於三次，所用的衝洗量、衝洗方法同方（fāng）法驗證試驗。衝（chōng）洗後，兩（liǎng）個濾器中加入硫乙醇酸鹽流體（tǐ）培養基各100ml，另一濾器中加入改（gǎi）良馬丁培養基（jī）100ml。
水（shuǐ）溶性固體供試品 取規定量，加適宜的稀釋液溶解或按（àn）標簽說（shuō）明（míng）複溶（róng），然後照水溶液供試（shì）品項下的方法操作。
非水溶性供試品 取規定量（liàng），混合溶於（yú）含聚（jù）山梨（lí）酯80或其他適宜乳化劑的（de）稀釋液300ml的無菌容器內，充分混（hún）合，立即（jí）過濾。用含0.1%～1%聚山梨酯（zhǐ）80的衝洗液衝洗濾膜，衝洗次數（shù）一般不少於三次。加（jiā）入含或不含聚山梨酯80的培養基。其他照水溶液供試品項下（xià）的方法操作。
可溶於十四烷（wán）酸異丙酯（zhǐ）的膏劑和粘（zhān）性油劑供試品 取（qǔ）規定量（liàng），混（hún）合至適量的無菌十四烷酸異丙（bǐng）酯①中，劇烈振搖，使供試品（pǐn）充分溶解，如果需要可適當加（jiā）熱，但溫度不得超過44℃，趁熱迅速（sù）過濾。對仍然無法過濾的供試品，於含有適量的無菌（jun1）十（shí）四烷（wán）酸異丙酯中的供試液中加入不少於100ml的稀釋液，充分振搖萃取，靜置，取下層水相作為供試液過濾。過濾後濾膜衝洗及加入培養基照（zhào）非水溶性製劑供試品項下的方法操作（zuò）。
無菌氣（噴）霧劑供試品 取規定量，將各容器置（zhì）至（zhì）少－20℃的冰室冷凍約1小時。以無菌操（cāo）作迅速在容器上端鑽一小孔，釋放拋射劑後再無菌開啟容器，並將供（gòng）試液轉移至無菌容器中，然後照水溶液或（huò）非水溶性製劑（jì）供試品項下的（de）方（fāng）法操作。
裝有藥物的注射器供試品 取規定量，將注射器中的內容物（wù）（若需要可（kě）吸入稀釋液或標簽所示（shì）的溶劑溶解）直接過濾，或混（hún）合至含適量稀釋液的無菌容器內，混勻，立即（jí）過濾。然後（hòu）按水溶性（xìng）供試（shì）品項下方法操作。
同時應采用直接接種法進行（háng）包裝中所配帶的無菌針頭（tóu）的（de）無菌檢查。
注： ①無菌十四烷酸異丙酯的製備 采用薄膜過濾法過濾除菌。選用孔徑為0.22μm的（de）脂溶性（xìng）濾膜(140℃幹熱（rè）滅（miè）菌2小時)過濾（lǜ）。
2. 直（zhí）接接種法
直接接種法適用於無法用薄（báo）膜過濾法進行無菌（jun1）檢查的供試品（pǐn）。 取規定量供試品,等量分別接種至硫乙醇酸鹽流體培養基和改良馬（mǎ）丁培（péi）養基中（兩種培（péi）養基的接種支/瓶數之比為（wéi）2：1）。除另有規（guī）定外，每個容器中培養基的用量應符合接種的供試品體積不得大於（yú）培養基（jī）體積的 10%，同時（shí），硫乙醇酸鹽流體培養基每管裝量不少於 15ml，改良馬丁培養基每管裝量不少於10ml。培養基的用量和高度同方法驗證試驗。
混（hún）懸液等非澄清水溶液供試品 取規定量，等（děng）量分別接種至各管培養（yǎng）基中。
固體供（gòng）試品 取（qǔ）規定量，加入適宜的稀（xī）釋劑溶解，或按標簽（qiān）說明複溶後，混合，等量分別接種至各（gè）管培養基中（zhōng）。
非水溶性供試品 取規定量，混合，加入適量的聚山梨酯 80或其它適宜的乳化劑及稀（xī）釋劑使其乳化，等（děng）量分別接種至各管培養基中。或等量分別直接接種至含聚山梨酯 80或其它適宜乳化劑的各管培養基中。
培養及觀察（chá）
將上述接種（zhǒng）後的硫乙醇酸鹽流（liú）體培（péi）養基平均分成兩份，一份置30℃～35℃培（péi）養 14天；另一份與接種後（hòu）的改良馬丁（dīng）培養基置20℃～25℃培養 14天，培養期間應逐日（rì）觀察並記錄是否有菌生長。如在加入供試品後、或在培（péi）養過（guò）程中，培（péi）養基出現渾濁，培養 14天後，不能從外觀（guān）上判斷有無菌生長，可取該培養液適量轉種至同（tóng）種新鮮（xiān）培養基中及營養瓊脂斜麵和改良馬丁瓊脂斜麵培養基（jī）上，細菌培養 2天、真（zhēn）菌培養 3天，觀察接種的同種新鮮培養基及營養瓊脂和改良馬丁瓊脂（zhī）斜麵培養基上是否有菌生（shēng）長；或取培養液（物）塗（tú）片，染色，鏡（jìng）檢，判斷（duàn）是否有菌，必要時（shí）作菌種（zhǒng）鑒（jiàn）定。
結果判斷
陽（yáng）性對照管應生長（zhǎng）良好，陰性對照管不得有菌生長。否則，試驗無效（xiào）。
若供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經確證（zhèng）無菌生長，判供試品符合規定；若供試品管中任（rèn）何一管顯渾濁並確證有菌生長，判供試品不符合規定，除（chú）非能充分證明試驗結果無（wú）效，即生長的微（wēi）生物非供（gòng）試品所含。當符（fú）合下列（liè）至少一（yī）個條件時方可判試驗結果無效（xiào）：
⑴ 無菌檢查試驗所用的設備及環境的微生物（wù）監控（kòng）結果不符（fú）合無菌檢查法的要求。
⑵ 回顧無菌試驗過程，發現有可能引起微生物汙染的因素。
⑶ 供試品管中生長的微生物經鑒定後，確證是因無菌試（shì）驗中所使用的物品和（或）無菌操作（zuò）技術不當（dāng）引起（qǐ）的。
試驗若經確認無效，應重試。重試時，重新取同量供試品，依法（fǎ）檢查，若無菌生長，判供試品符合規定；若（ruò）有菌生長，判供試品不符合規定。
表1 出廠（chǎng）製品不同規格及原液和半（bàn）成品最少抽驗數量
供試（shì）品
批產量(N)；裝量（V）
最少抽（chōu）驗數量
注射劑（jì）
N≤100
5個
100＜N≤500
10個（gè）
N＞500
20個
凍幹血液製品
V＞5ml
每櫃凍幹N≤200個（gè）
5個
每櫃凍幹N＞200個
10個
V≤5ml
N≤100
5個
100＜N≤500
10個
N＞500
20個
原液或半成品
每個容器取樣，取樣量（liàng）為每（měi）個容器（qì）製品總量的0.1%或不少於10ml。每開瓶一次，應如上法抽驗（yàn）。體外用診斷製品半成品每
批抽驗量應不少於3ml。
表2上市製品監督抽驗數量（liàng）
品種及裝量（V）
最少抽（chōu）驗數量
血液製品 V＜50ml
6個
V≥50ml
2個
其他生物製品
10個
表3 不同規格製品的最少接種量
規格
每支（瓶）供試品的最少接種量
液體製（zhì）劑（ml） ≤1
全量
1＜V≤5
半量
5＜V＜20
2ml
20≤V＜50
10ml
V≥50
半量
原液或半成品
半量
固體製（zhì）劑 ＜50mg
全量
50mg≤M＜300mg
半量
300mg≤M＜5g
150mg
M≥5g
半量
售前谘詢