上海秉越電子儀器有限公司

產品（pǐn）采集（jí）與樣品處理

於同一（yī）批 號的 二個運輸包裝中至少抽取 12個（gè）蕞小銷售包裝樣品，1/4樣品（pǐn）用於檢測，1/4樣品用於留樣，另 1/2樣品（可就地封存）必要時用於複（fù）檢。抽樣的蕞小銷售包裝不應有破裂，檢驗前不得啟開。

在100級淨化條件下用無菌方法打開用於（yú）檢測的至少（shǎo） 3個包裝，從每個包裝中取樣（yàng），準確稱取10g±1g樣（yàng）品。剪碎後加人到（dào）200ml滅（miè）菌生理鹽水中，充分混勻，得到（dào）一個生（shēng）理鹽水樣液。液體產（chǎn）品用原液直接做樣液。

如被檢樣品含有大量吸水樹脂材料而導致不能吸出足夠樣液時，稀（xī）釋液量可按每次 50ml遞（dì）增，直至（zhì）能（néng）吸出足夠測試用樣液。在計算細菌菌落總數與真菌菌落總數時相應調整稀釋度。

B2  細菌菌落總（zǒng）數與（yǔ）初始汙染菌檢測方法

本方法適用於產品初始汙染菌與（yǔ）細菌菌落總數（以下（xià）統稱為細菌菌落總數）檢測。

B2.1 操作步驟

待上述生（shēng）理鹽水樣液自（zì）然沉（chén）降後取上清液（yè）作（zuò）菌落計數。共接種 5個平皿，每個平皿中加人 1ml樣液，然後用冷卻至45℃左右的熔（róng）化的營養瓊脂培養基 15～20ml倒人每個平皿（mǐn）內混合均勻 。待瓊脂凝固後翻轉平皿（mǐn）置 35℃±2℃培養 48h後，計算平板上的菌落（luò）數。

B2.2 結果（guǒ）報告

菌（jun1）落呈片狀生長的平板不宜采用（yòng）；計數符合要求的平板上（shàng）的菌落，按式（B1）計算結果（guǒ）：

X1=A×（K÷5）

式中X1—–細菌（jun1）菌落總數 cfu/g或cfu/mL；

A——5塊營養瓊脂培養基平板上的細菌菌落總數；

K——稀釋度。

當菌落數在（zài） 100以內，按實有數報告，大於 100時采（cǎi）用二位有效數字。

如果樣品菌落總數超過本標準的規定，按 B2.3進行複檢（jiǎn）和結（jié）果報告。

B2.3 複檢方法（fǎ）

將留存的複檢樣（yàng）品（pǐn）依（yī）前法複測 2次，2次結果平均（jun1）值都達到本標（biāo）準（zhǔn）的規定，則判定（dìng）被檢樣品合（hé）格；其中有任（rèn）何 1次結（jié）果平均（jun1）值超過本標準規定，則判定被（bèi）檢樣品不（bú）合格。

B3  大腸菌群（qún）檢測方法

B3.1 操作步驟

取樣液 5ml接種（zhǒng） 50ml，乳糖膽鹽發酵管，置（zhì） 35℃±2℃培養 24h，如不（bú）產酸（suān）也不（bú）產氣，則報告為大腸菌（jun1）群陰性（xìng）。

如產酸產（chǎn）氣，則劃線接種伊紅美藍瓊脂平板，置35℃±2℃培養 18～24h，觀察平板上（shàng）菌落形態。典型的大（dà）腸菌（jun1）落為黑紫色或紅紫色，圓（yuán）形，邊緣整齊，表麵光滑濕潤，常具有金屬光澤（zé），也有的呈紫黑色，不帶或略（luè）帶金屬光澤，或粉紅色，中心較深的菌（jun1）落。

取疑似菌落 1-2個作革蘭氏染色鏡檢，同時接（jiē）種（zhǒng）乳糖發醉管，置 35℃±2℃培養 24h，觀察產氣情況。

B3.2 結果報告（gào）

凡乳糖膽（dǎn）鹽發酵骨產酸產氣，乳糖發酵管產酸產氣，在伊紅美藍平板上有典（diǎn）型（xíng）大腸菌落，革蘭氏（shì）染色（sè）為陰（yīn）性無芽胞杆（gǎn）菌，可報告被檢樣品檢出大（dà）腸杆菌。

B4  綠膿杆菌檢（jiǎn）測（cè）方法（fǎ）

B4.1 操作步驟

取樣（yàng）液 5ml，加人到50ml SCDLP培養液中，充分混勻（yún），置（zhì） 35℃±2℃培養 18～24h。如有（yǒu）綠膿（nóng）杆（gǎn）菌（jun1）生長（zhǎng），培養液（yè）農麵呈現一（yī）層薄菌膜，培養液常呈黃（huáng）綠色或藍（lán）綠色。從培養（yǎng）液（yè）的薄菌膜處挑取培養物，劃線接種十六烷三甲基溴化胺瓊（qióng）脂平板，置 35℃±2℃ 培養 18～24h，觀察菌落特征。綠膿杆菌在此培養基上生長良好，菌落扁（biǎn）平，邊緣不整，菌落周圍培養基略（luè）帶粉紅色，其他（tā）菌不長。

取可疑菌落塗片作革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陰性菌者應進行下列試驗：

氧化酶試驗（yàn）：取（qǔ）一小塊潔淨（jìng）的白色濾紙片放在滅菌平皿內，用無菌玻棒挑取可（kě）疑菌落塗在濾紙片上，然後在其上滴加一（yī）滴新配製的 1%二甲基對苯二胺試液，30s內出現粉紅色（sè）或紫（zǐ）紅色，為氧化酶試驗陽性，不變色者為陰性（xìng）。

綠膿菌素試驗：取2-3個可疑菌落，分別接種在綠膿菌素測定（dìng）用（yòng）培養基斜麵，35℃±2℃培養24h，加入 3～5ml，充分振蕩使培養物中可能存在的綠膿菌素溶解，待三-氯-甲-烷（wán）呈藍色時，用（yòng）吸管移到另一試管中並加人 1mol/L的鹽酸1mL，振蕩後靜（jìng）置（zhì）片刻（kè）。如上（shàng）層出現粉紅色或紫（zǐ）紅色即為陽性，表示有綠膿（nóng）菌素存在。

硝酸鹽還原產（chǎn）氣試驗：挑（tiāo）取被檢菌落純培養物接種在硝酸鹽脈水培養基中，置 35C12C培（péi）養24h培（péi）養基小倒管中有（yǒu）氣者即為（wéi）陽性

明膠液化試驗:取可疑菌落純培養物，穿刺接種在明膠培養基內，置 35℃±2℃培養 24h，取出（chū）放於4～10C，如仍呈液態為陽性，凝固者為陰性。

42℃生長試（shì）驗：取可疑培養物，接種在普通瓊（qióng）脂斜麵培養基上，置（zhì） 42℃培養（yǎng） 24～48h，有綠膿杆菌生長為陽性。

B4.2 結果（guǒ）報告

被檢樣品經增菌分離培養後，證實為革蘭（lán）氏陰性杆菌（jun1），氧化酶及綠膿杆菌試驗均為陽性者，即可報告被檢（jiǎn）樣品中檢出綠膿杆菌（jun1） 如綠膿菌素試驗陰性而液（yè）化明膠、硝酸鹽還原產（chǎn）氣和42℃生長試驗三者皆（jiē）為陽性時，仍可（kě）報告被檢樣品中檢出綠膿杆菌。

B5 金黃色葡萄球菌檢測方法（fǎ）

B5.1 操作步驟

取（qǔ）樣液（yè） 5ml，加入到 50mL SCDLP培養（yǎng）液中，充分混勻，置 35℃±2℃培養 24h，自上述增菌液中取1～2接種環，劃線接種在血瓊脂培養基（jī）上，置 35℃±2℃培養24～48h。在血瓊（qióng）脂平板上該菌菌（jun1）落呈金黃色（sè），大而突起，圓形，不透明，表麵光滑，周圍有溶血圈。

挑取典（diǎn）型菌落，塗片作革蘭氏染色鏡檢，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，排列成葡萄狀，無芽胞與莢膜。鏡檢符合（hé） 上述情況，應進行下列試驗：

甘露醇發（fā）酵（jiào）試驗：取上述菌落接種甘露醇培養液，置 35℃±2℃培養 24h，發（fā）酵甘（gān）露醇產酸者為陽性。

血漿凝固（gù）酶試驗：（1）玻片法：取清潔幹燥（zào）載玻（bō）片，一端（duān）滴加一滴生理鹽水，另一端滴加一滴兔血漿，挑:取（qǔ）菌落分別與生理鹽水和血漿（jiāng）混合，5min如血漿內出現團塊或顆粒狀凝塊（kuài），而鹽水滴仍呈均勻混濁無凝（níng）固則為陽性，如兩者均無凝固則（zé）為陰性。凡鹽水滴與血漿滴均有凝固現象，再進行試（shì）管凝固酶試驗（yàn）；（2）試管法：吸取 1：4新鮮血漿（jiāng） 0.5ml，放滅菌小試管中，加入等量待檢菌 24h肉湯培（péi）養物 0.55mL，混勻，放 35℃±2℃溫箱或水（shuǐ）浴中，每半小時觀察一次，24h之內呈現凝塊即為陽性。同時以已（yǐ）知血漿凝固酶陽性和陰性菌株肉湯培養物各0.5ml，作為陽性與陰性對照。

B5.2 結果報告

凡在瓊脂平板（bǎn）上有可疑菌落生長，鏡檢為（wéi）革蘭氏陽（yáng）性葡萄球菌，並能發酵甘（gān）露醇產酸，血漿凝固（gù）酶試驗陽性（xìng）者，可報告被檢樣品檢出金黃色葡萄球菌。

B6 溶血性鏈球菌檢（jiǎn）測方法

B6.1 操作步驟

取樣液 5ml加人到 50ml葡萄糖肉湯（tāng）， 35℃±2℃培養 24h，將培養物劃線接種血瓊脂平板（bǎn）， 35℃±2℃培養24h觀察菌落特征。溶血性鏈球菌在血平板（bǎn）上為灰自色，半透明或不透明，針尖狀突起，表麵（miàn）光滑，邊緣整齊，周圍有（yǒu）無色透明溶血圈。

挑取典型菌（jun1）落作塗片革蘭氏染色鏡檢，應為革蘭氏（shì）陽性，呈鏈狀（zhuàng）排列的球菌（jun1）。鏡檢符合上述情況，應進（jìn）行下列試（shì）驗：

鏈（liàn）激酶試驗：吸取草酸鉀血（xuè）漿 0.2ml（0.01g草酸鉀（jiǎ）加5mL兔血（xuè）漿混勻，經離心沉澱，吸（xī）取上清液），加人 0.8ml滅（miè）菌生理鹽水，混勻後（hòu）再加人待檢菌 24h肉湯培養（yǎng）物0.5ml和0.25%氯化鈣（gài）0.25ml，混勻，放 35℃±2℃水浴中，2min觀察一次（一般10min內可凝固），待血漿凝固後繼續觀察並記（jì）錄溶化時間（jiān）。如 2h內不溶化（huà），繼續放置 24h觀察，如凝塊全部溶化為（wéi）陽性，24h仍不溶化為陰性。

杆菌（jun1）膚敏感試驗：將被（bèi）檢菌菌液（yè）塗（tú）於血平（píng）板上，用滅菌鑷子取每（měi）片含 0.04單位杆菌（jun1）膚的紙片放在平板（bǎn）表麵仁，同時以已知陽性（xìng）菌株作對照，在 35℃±2℃下放置 18～24h，有抑菌帶（dài）者為陽性。

B6.2 結果報告

鏡檢（jiǎn）革蘭氏陽性鏈狀排列球菌，血平板（bǎn）上呈現溶血圈，鏈（liàn）激（jī）酶和杆菌膚試驗陽性，可報告被（bèi）檢（jiǎn）樣品檢（jiǎn）出溶血性鏈球菌。

B7 真菌菌落總數檢測（cè）方（fāng）法

B7.1 操作（zuò）步驟

待上（shàng）述（shù）生理鹽水樣液自然沉（chén）降後取上清液作真（zhēn）菌計數。共接種5個平皿，每個平皿中加（jiā）人 1ml樣液，然後用冷卻至（zhì） 45℃左右的熔化的沙氏瓊脂培養基 15 ～25mL倒人每個平皿內混合均勻，瓊脂凝固（gù）後翻轉平皿置 25℃±2℃培養 7天，分別於 3，5，7天觀察，計算平板（bǎn）上的菌落數，如果發現菌（jun1）落蔓延，以前 一次的菌落計數為準（zhǔn）。

B7.2 結果報告

菌落呈片狀生長的平板不宜采用；計數符合要求的平板上的菌落，按式（B2）計算結果：

X2=B×（K÷5）

式中X2—–真菌（jun1）菌落總數，cfu/g或cfu/mL；

B—–5塊沙氏瓊脂培養基（jī）平板上的（de）真菌（jun1）菌落總（zǒng）數（shù）;

K—–稀（xī）釋度。

當菌落數在 100以內，按實有數報告，大於 100時采用二（èr）位有效數字。

如果樣品菌落總（zǒng）數超過本標準的規定，按 B7.3進行複檢和結果報告。

B7.3 複檢方法

將留存的複檢樣品依前法複測 2次，2次結果都達到（dào）本標（biāo）準的規定（dìng），則判定被檢樣品合格；其中有任何（hé） 1次結果（guǒ）超過本（běn）標準規定，則判定被檢樣品不合格。

B8 真（zhēn）菌定性檢測方法

B8.1 操（cāo）作步驟

取樣（yàng）液 5mL加（jiā）入到50mL沙氏（shì）培養基中， 25℃±2℃培養 7天（tiān），逐日觀（guān）察有（yǒu）無真菌生長。 

B8.2 結果報告

培養管混濁應轉種沙氏（shì）瓊脂培養基，證實有真菌（jun1）生長，可報（bào）告被檢樣品檢出真菌。