上海秉越（yuè）電子儀器有限公司

1.有（yǒu）機（jī）物中的胺根在強熱和CuSO4，濃H2SO4作用下，硝化生成（NH4）2SO4
反應式為
2NH2 H2S04 2H＝（NH4）2S04（其中（zhōng）CuSO4做催化劑）
2.在（zài）凱氏定氮器中與堿作用，通過蒸餾釋放出NH3，收（shōu）集於H3BO3溶液中
反應式為:
（NH4）2SO4 2NaOH＝2NH3 2H2O Na2SO4
2NH3 4H3BO3＝（NH4）2B4O7 5H2O
3.用已知濃度的H2SO4（或HCI）標準溶液滴定，根據HCI消耗的量計算出氮的（de）含量，然後乘以相應的（de）換算因子，既得蛋白質的含量點焊機
反應式為：
（NH4）2B4O7 H2SO4 5H2O＝（NH4）2SO4 4H3BO3（NH4）2B4O7 2HCl 5H2O＝2NH4Cl 4H3BO3

凱氏定（dìng）氮儀（yí）操作步驟：（一）消化1、準備6個凱氏燒瓶，標號（hào）。1、2、3號燒瓶中分（fèn）別加入適當濃度的蛋白（bái）溶液1.0mL，樣品要加到（dào）燒瓶底部，切勿沾在瓶（píng）口及瓶頸上。再依次加入硫酸鉀-硫酸銅接觸劑0.3g，濃硫（liú）酸2.0mL，30%過氧化氫1.0mL。4、5、6號燒瓶作為空白對照，用以測定試（shì）劑中可能含有的微量（liàng）含氮物質，對樣品測定進行校正。4、5、6號燒瓶中加入蒸餾水1.0mL代替樣液，其餘所加試（shì）劑與1、2、3號燒瓶相同。2、將加好試劑的各燒瓶放置消化架上（shàng），接好抽氣裝置。先用微火（huǒ）加熱煮沸，此時燒瓶內物質（zhì）炭化變黑，並產生（shēng）大量（liàng）泡沫，務必注意防止（zhǐ）氣泡衝出管口。待泡沫消失停（tíng）止產生後，加（jiā）大火力，保持瓶內液體微沸，至溶液澄清後，再繼續（xù）加熱使消化液微沸15min。在消化過程中要隨時轉動燒瓶，以使內壁粘著物質均能流入底部，以保證樣品完（wán）全消化。消化時放出的氣體內含SO2，具有強烈刺激性，因此自始自終應打開抽水泵將氣（qì）體抽入自來水排出。整個消化過程均應在通風櫥中進行。消化完全後，關閉火焰，使燒瓶冷卻至室溫。（二）蒸餾和吸收蒸餾和吸收（shōu）是在（zài）微量凱氏定氮儀內進行的。

凱氏定氮蒸餾裝置種（zhǒng）類甚（shèn）多，大（dà）體上都由蒸氣發生、氨的蒸餾（liú）和氨的吸收三部分組（zǔ）成。

1、儀器的洗滌儀器安裝前，各部件需經（jīng）一般方法洗滌幹淨，所用橡皮管、塞須（xū）浸在10%NaOH溶液中（zhōng），煮約10min，水洗、水煮10min，再（zài）水洗數次，然後安裝並固定在一隻（zhī）鐵架台上。儀器使用前，微量全部管道都（dōu）須經水（shuǐ）蒸氣洗（xǐ）滌，以除去管道內可能殘留的氨，正在使（shǐ）用的儀器，每次測樣前，蒸氣（qì）洗滌5min即可。較長時（shí）間未使用的儀器（qì），重複（fù）蒸氣洗滌，不得少於三次，並檢查儀器是（shì）否正（zhèng）常。仔細檢查各個連接處，保證不（bú）漏氣。首先在蒸氣發生器中加約2/3體積蒸餾水（shuǐ），加入數滴硫酸（suān）使（shǐ）其保持酸性，以避免水中的氨被蒸出而影響結果，並放入少許沸石（或毛細管等），以防爆沸。沿小玻杯壁加入蒸餾水約20mL讓水經（jīng）插管（guǎn）流入反應室，但（dàn）玻杯內的水不要放（fàng）光，塞上棒狀玻（bō）塞，保持水封，防止漏氣（qì）。蒸氣發生後，立即關閉廢液排放管上的開關，使蒸氣隻（zhī）能進入反應室，導致反應室內的水迅速沸騰，蒸（zhēng）出蒸氣由反應室上（shàng）端口通過定氮球進入冷凝管冷（lěng）卻（què），在冷（lěng）凝管下端放（fàng）置一個錐形瓶接（jiē）收冷凝水。從定氮球發燙開始計（jì）時，連續蒸煮5min，然（rán）後（hòu）移開煤氣燈。衝洗完（wán）畢，夾緊（jǐn）蒸氣發（fā）生器與收集器之間的連接橡膠管，由於（yú）氣體冷卻壓力降低，反應室內廢液自動（dòng）抽到反應室外殼中，打開廢液排出口夾子放出廢液（yè）。如此清（qīng）洗2～3次，再在（zài）冷凝管下換放一個盛有硼酸-指示（shì）劑混（hún）合（hé）液的錐形瓶使冷凝管下口完全浸沒在溶液中，蒸（zhēng）餾1～2min，觀察錐形瓶內的溶液是否變色。如（rú）不變色，表示蒸餾裝置內部已洗幹淨。移去錐形瓶，再蒸餾1～2min，用蒸餾水衝洗冷凝器下口，關閉煤（méi）氣燈，儀器即可供測樣（yàng）品使用。

2、無機氮標準（zhǔn）樣品的蒸餾吸收由於定（dìng）氮操作繁瑣（suǒ），為了熟悉蒸餾和滴定的操作技術，初學者宜先用無機氮標準樣品（pǐn）進行反複練習，再進行有（yǒu）機（jī）氮未知樣品的測定。常用巳知濃度的標準（zhǔn）硫酸（suān）銨測試（shì）三次。取潔（jié）淨的100mL錐形瓶（píng）五隻，依次加入2%硼酸溶液20mL，次甲基藍-甲基紅混合指示劑（呈紫紅色）3～4滴，蓋（gài）好瓶口待用。取其中一隻錐形瓶承接在冷凝管（guǎn）下端，並使冷（lěng）凝管的出口浸沒在溶液中。注意：在此操作之前必須（xū）先（xiān）打開收集（jí）器活塞，以免（miǎn）錐形瓶內液體倒吸。準確吸取2mL硫酸（suān）銨標準液加到（dào）玻杯中（zhōng），小心（xīn）提起棒狀玻塞使硫酸銨溶（róng）液慢慢流入蒸餾瓶中，用少量蒸餾水衝洗小玻杯3次，一並放人（rén）蒸餾瓶（píng）中。然後用量筒（tǒng）向小玻杯中加入10 mL 30%NaOH溶（róng）液，使堿液慢慢流入蒸餾瓶中（zhōng），在堿液尚未完全流入時，將棒狀玻塞蓋（gài）緊。向小（xiǎo）玻杯中加約5mL蒸餾水，再慢慢打開玻（bō）塞，使一半水（shuǐ）流入蒸餾瓶，一半（bàn）留在小玻杯中作水封。關閉收集器活塞，加熱蒸氣（qì）發生器，進行蒸餾。錐形瓶中的硼酸-指示劑混合液由於吸（xī）收了氨，由紫紅色變成綠色。自變色時起，再蒸餾（liú）3～5min，移動錐形瓶（píng）使瓶內液麵離開冷凝管下口約lcm，並用少量蒸餾水衝洗冷凝管下口（kǒu），再繼續蒸餾1min，移開錐形瓶，蓋好，準備滴定。在一次蒸餾完畢後，移去煤氣燈，夾緊蒸氣發生（shēng）器與收集器間的橡膠管，排除反應完畢的廢液，用水衝洗小玻杯幾次，並將廢（fèi）液排除。如此（cǐ）反複衝洗幹淨後，即可進行下一個樣（yàng）品的（de）蒸餾。按以上方法用標（biāo）準硫酸銨再做（zuò）兩次。另取2mL蒸餾水代替標準硫酸（suān）銨（ǎn）進行空白測（cè）定二次。將（jiāng）各次蒸餾的錐形瓶一起（qǐ）滴定。

3、未知樣（yàng）品及空白的（de）蒸餾吸（xī）收將消化好的蛋白樣品（pǐn）三支，空白對照液三支，依（yī）次作蒸餾吸收。加5mL熱的蒸餾（liú）水至消（xiāo）化好的（de）樣品或空白對照液中，通過小玻杯加到反應室中，再用熱蒸餾水洗（xǐ）滌小（xiǎo）玻杯3次，每次用水量約3mL，洗滌液一並倒入（rù）反應室內。其餘操作按標準硫（liú）酸銨的蒸餾進行。由於消化液內硫酸鉀濃度高而呈粘稠狀，不易從凱氏（shì）燒瓶（píng）內倒（dǎo）出（chū），必須加入熱蒸餾水5 mL稀釋之（zhī），如果有結晶（jīng）析出，必須微熱溶（róng）解，趁熱加入（rù）玻杯，使其流入反應室。此外，還應當注意趁儀器（qì）洗滌（dí）尚未完全冷卻時立即加入樣品（pǐn）或空白對照液，否則消化液通（tōng）過冷（lěng）卻的管道容易析出結晶，造成堵塞。（三（sān））凱氏定氮儀滴定樣品和空白蒸餾完畢後，一起進行滴定。打開（kāi）接受瓶蓋，用酸式微量滴定管（guǎn）以0.0100mol/L的（de）標準鹽（yán）酸溶液進行滴定。待滴至瓶內溶液呈暗（àn）灰色時（shí），用蒸餾（liú）水將錐形瓶內壁四周淋（lín）洗（xǐ）一次。若振搖後複現綠色，應再小心滴入標準（zhǔn）鹽（yán）酸溶液半（bàn）滴，振搖觀察瓶內溶液顏色變化，暗灰色在一二（èr）分鍾內不變，當視（shì）為到達滴（dī）定終點。若呈（chéng）粉紅色，表明已超越滴定（dìng）終點，可在已（yǐ）滴定（dìng）耗用的（de）標準（zhǔn）鹽酸溶液用量中減去0.02mL，每組（zǔ）樣品的定（dìng）氮終點顏色必須完全一致。空白對照（zhào）液接受（shòu）瓶內的（de）溶液顏色不變或略有變化尚未出現綠色，可以不滴定。記錄每次滴（dī）定耗用標準鹽酸溶液毫升數，供計算用。