上海秉越電子儀器有限公司

OOS(outofspecification,超限度、超規格)結果，是指產品質量指標測試中超（chāo）出已經建立的可接受標準的（de）單（dān）個或一係列結果。無菌（jun1）產（chǎn）品的陽性結果（guǒ）、微生物限度試驗超出行動值或超過規格、內毒素試（shì）驗結果超標準（zhǔn）等（děng）均為OOS結果《中國藥典》2015年版（bǎn）m和新版《藥品生產質量管理規（guī）範》（GMP)增加了OOS調查章節，對（duì）微（wēi）生物實驗室00S結果的調查做出了（le）較為詳細（xì）的闡述和實例分析，要求任何OOS結果必須按照書麵規（guī）程進行完整（zhěng）的調查。因（yīn）為隻有確定了OOS結果產生的原因並判定其（qí）是否有效，進而（ér）才能製訂完善的預防和整（zhěng）改措施，以保證（zhèng）檢驗結果的準確性。因此，實驗室建立OOS調查處理程序，對OOS結果進行科（kē）學、及（jí）時、有效的調查分析處理（lǐ）是十（shí）分必要的微生物在自（zì）然環境（jìng）中無處不（bú）在，並可能會隨檢驗人員（yuán）、檢驗用器材以及檢品（pǐn）的包裝容器進入（rù）檢驗環境。因此（cǐ），關於微生物檢驗中藥品的無菌檢査（chá）項目，新版藥典對其操（cāo）作（zuò）環境提出了更高要求，新版GMP也加強了對無菌操作環境空氣微生物、表麵微生物以及人員（yuán）手套和（hé）操作服表麵微生物的監測頻率，並做（zuò）出了明（míng）確規定。而對於無菌檢（jiǎn）査OOS結果的調査，需核實（shí）的相關記錄和影響因素更為繁雜。基於它的複雜性，OOS結果的調查（chá）須追溯到實驗過程的每一個環節，而對於它的變異性，調查過程又需針對不同的OOS結果（guǒ）著重分析調查相應的不同環節。
對於（yú）微生物實驗室OOS的調查，局限於每個檢驗（yàn）單位的技術水平和資源，同樣限於人類對微（wēi）生物掌握的（de）局限，不是每次的OOS調査都可以發現其根本原因，但（dàn）通過此調査過程仍（réng）能夠幫助（zhù）調（diào）查者找出超（chāo）標結果發（fā）生的可能原因並（bìng）進而采取糾正預防措施，基於風險分析，對相關批次產品做出最後處理決定'從而（ér）降低藥（yào）品質量風（fēng）險，既（jì）是保證藥品（pǐn）質量的（de）重（chóng）要工作，又是質量體係持續改進的原動力。本文通過（guò）對4批無菌產品（pǐn）的無菌檢査實驗全過程的回顧（gù）性分析和調（diào）查，探索導致無菌實驗OOS結果的明確原因，以期建立微生物實驗室完善的OOS調査方案。
1、材料、儀器與試劑
全自動智能無菌集菌儀（yí）(上海秉（bǐng）越zw-2008)一次性使用全封（fēng）閉集菌培養器顯微（wēi）鏡AxiosescopeA
全自動（dòng）微生物（wù）鑒定儀
酵母菌鑒（jiàn）定卡
無菌檢查樣品為4個批（pī）號的注射用頭孢噻膀鈉。
2、方法與結果
2.1實驗方法
 
2.1.1藥（yào）品的無菌檢查
依照《中國藥典》2010年版_檢驗注射（shè）用頭孢噻肟（wò）鈉的無菌檢查項目。
2.1.2鏡檢及（jí）鑒定
取陽性樣本，劃線TSA平板培養24~48h，按照儀器及試劑的（de）使用說（shuō）明（míng），對經過純化的微生物進行革蘭氏染色，確定微生物形態，然後根據形態選擇鑒定卡，使用全自動（dòng）微生物鑒定儀Vitek2Compact進行鑒定。
 
2.2結果
 
4個批號的注射（shè）用頭孢噻肟鈉的無菌檢查檢（jiǎn）驗結果如表1所示：2號和（hé）4號樣品改良馬丁培養（yǎng）基均在第3天變渾濁（zhuó）。取改良馬丁培（péi）養液劃線TSA平板，30~35℃培養（yǎng）48h，平板上呈現白色（sè）、光滑、邊緣整齊、形態（tài）單一的菌落。
革蘭氏染（rǎn）色鏡檢結果為酵母菌。經全自動微生物鑒定儀（yí）Vitek2Compact鑒定，均為季也蒙假絲酵（jiào）母。
 
3、OOS結果的調查和分析
依據新（xīn）版GMP對OOS調查的要求，回顧性分析調（diào）查注射用頭孢噻肟鈉無菌檢查OOS結果產生的原因。
 
①日常監控和驗收記（jì）錄：
培養基的驗收記錄、培養基的製備和滅菌記錄、檢驗器具準（zhǔn）備和滅菌記錄、消毒液配置和無菌過濾記錄、潔淨室清潔消毒記錄、檢驗員使用潔淨服的滅菌（jun1）記錄和使用記錄、無菌檢驗操作記錄以及環境監控記錄等均未（wèi）發現異常（cháng）。
②人員：
甲和乙實驗人員均能熟練掌握無菌檢驗的流程、監控要點和（hé）無菌操作規（guī）範。
③樣品：
確認樣品的編號和批號無誤，無菌檢査（chá）取樣前，樣品西林瓶外觀正常，西林瓶蓋並未發（fā）現（xiàn）鬆動的跡象。
④實驗器具：
實驗中使用的py330集菌器、一次件（jiàn）使用無菌注射器以及一次性使用無菌手套的無菌驗收均符合規定（dìng），且用於當天其他檢品的檢驗，並未（wèi）發現汙染情況。
⑤培養基（jī）及衝洗（xǐ）液（yè）和稀釋（shì）液：
無菌檢查用培（péi）養基的陰性對照均符合規定（dìng），且同批製備和滅菌的培養基用於同日檢查的其他檢品，並未發現汙（wū）染情況。
⑥檢驗環境：
現場環境監控的3皿沉降菌監測的TSA平皿均未有菌落生長，並未出現汙染情況。定期環境檢測表麵菌符合規定，樣品無菌檢查當日潔淨空調係統均運行正常。
⑦不（bú）同檢驗體（tǐ）係（xì）對結果判定造成的影響（xiǎng）：
由於現行《中國藥典》無菌檢查使（shǐ）用的改良馬（mǎ）丁培養基不同於國際標準使用的TSB,將改良馬丁培養物劃線TSA平板上（shàng）長（zhǎng）出的菌落接種至TSB培養液中in),24h後培養液即出現混濁現象。因（yīn）此可以排除因檢驗體係不同（tóng）造（zào）成的實（shí）驗結果偏差。
⑧菌株：
樣品檢（jiǎn）出菌（jun1）經鑒定為季（jì）也蒙假絲酵母菌，比對（duì）曰常潔淨（jìng）室監控收集的菌株建（jiàn）立的菌庫，潔淨室中從未監（jiān）測到此種菌株。
⑨附加（jiā）實驗的結果（guǒ）與分析：
通過以上分析，初步認定無菌不合格為（wéi）實驗有效結果。但鑒於此次無菌檢驗過程並未嚴格按照新版GMP和（hé）《中國藥典》2015年版規定的（de）對檢驗環（huán）境和人員（yuán）的全麵監控，環境和人員帶來的（de）汙染（rǎn）仍有造成OOS結果的可能性，附加實驗就是對檢驗環境進（jìn）行全（quán）麵監測。
現場環境監控按照新版GMP的要求實施（shī），並增加對潔淨室回風口浮（fú）遊菌的監測，監測結果均符合（hé）規定。微生物監測方麵，除（chú）實驗（yàn）人員無菌服胸口處采集到（dào）一個菌落，其他均未有（yǒu）菌落生長。實驗人員無菌服采集到的菌落為革蘭氏陽性球菌，經鑒定為Kocuriakristinae(克（kè）氏庫克菌），此菌種曾在（zài）日常（cháng）潔淨室監控中不止（zhǐ）一次檢出（chū）過，並未對樣品產生過（guò）汙染。
4、結論與討論
OOS結（jié）果表明，並未在實（shí）驗室發現導致OOS結果的（de）明確原因，檢出菌（jun1）也並非由於實驗室（shì）檢（jiǎn）驗過程帶來的汙染，懷疑樣品本身被季也蒙假絲酵母菌所汙染，從而導致無菌檢（jiǎn）查的陽性結果。
通（tōng）過對上述OOS的調查和（hé）分析，初步建立了微生物實驗室OOS結果調查的分（fèn）析方案，分別從人、機（jī）、料、法、環5個方麵進行闡述：
人——實驗人員。考察人員是否經過相關檢驗的培訓和考核，是否了解該項檢驗的流程和監控要點。無（wú）菌區全體人員每年應（yīng）進行一次再培訓和資格的再確認，對無菌區人員操作服和手套表麵的微生物監測（cè）嚴格按新版GMP執行；
機——實（shí）驗中（zhōng）使用的儀（yí）器設備。檢查（chá）集菌儀等（děng）儀器近期使用（yòng）記錄是否發現異常，參數設置是否正確。儀器的計量和校（xiào）準（zhǔn）均需在有（yǒu）效期內，無菌區（qū）內（nèi）使用的儀（yí）器需（xū）定期消毒並定期進行微生物的表麵監測，使用的器具（jù）需經滅菌消毒，一次性使用器具（jù）需經質量驗收；
料——樣品、培（péi）養基、稀釋液和衝洗液。檢查剩（shèng）餘樣品的編號和批號（hào）是否準確，樣品的外觀是否異常，瓶蓋是（shì）否有鬆脫現象以及樣品的前期存放條件和取（qǔ）樣方式是否合理。必要時，對樣品的（de）瓶蓋和瓶口等關鍵（jiàn）部（bù）位擦抹取樣，培養觀察；
檢查培養基質量驗收（shōu）記錄和配製記錄（lù），確認配製和滅菌是否合理有效（xiào），是否用於其他樣品的檢驗，培養基（jī）、稀釋液和衝洗液的陰性對（duì）照應符合規定；
法——檢驗方法和（hé）依據。實驗所用標（biāo）準應符合（hé）設定實驗和檢驗依據的要求；
環——實驗環境。檢查潔淨空調係統（tǒng）是否運行正（zhèng）常，監測記錄包括定期監（jiān）控記錄和實驗現場環境監控記（jì）錄，是否符合潔淨度要求，清潔記錄顯（xiǎn）示是否按時清潔，消毒液是否使用合（hé）理。另外，未確定OOS結果產生的（de）明確原因時，不能急於對（duì）環境進行消毒處理，以（yǐ）免（miǎn）忽略了可能的環境汙染因素。
 
微生物負（fù）荷（hé）和實驗（yàn）檢出菌的比對分（fèn）析。實驗室的微生（shēng）物負荷，包括潔淨室的空氣微生物、表（biǎo）麵（miàn）微生物和人員操作服及手套的表麵微生物。對日常環境監控收集的菌株進行有效（xiào）鑒別和（hé）分析，建立潔淨室生物負載（zǎi）數據庫，可為微生物OOS調（diào）査提供數據（jù）基礎。
 
對檢出菌進行鑒定，分析監控收（shōu）集的微（wēi）生物分布和鑒定與（yǔ）陽性結果的相關（guān）性，當發現與（yǔ）陽性菌株相（xiàng）近的菌（jun1）株時，可利用分子生物學方法比對陽性（xìng）菌株與微生物負荷的同源性，為陽性菌的汙（wū）染溯源提供依據。
此外（wài），對不同實驗會產生（shēng）不（bú）同的OOS結果，可針（zhēn）對某些相（xiàng）關環節靈活考察。例如，針對不同的微生物，采用不同的監測手段，陽性檢出菌為酵母菌時，增（zēng）加沙氏葡萄糖（táng）瓊脂用於環境監控的附加實驗，則（zé）能夠更好地確認環境中的該類微生物。
需要著重強調的（de）是，檢出菌的鑒別對於OOS結果的調查非常關鍵，決定最後是否可以（yǐ）發現根本（běn）原因（yīn），應該給予足夠重視。
綜上所述（shù），微生物相關檢驗項目OOS結果的調查工作量很大，且專業性強，實驗室不（bú）僅需要具備受過良好培訓和具有豐富（fù）檢驗（yàn）經驗的工作（zuò）人員，還需建立完（wán）善的OOS調查方案來規範調查操作。